背景

任何固相萃?。?/span>SPE）或樣品制備方法開發(fā)的目標(biāo)都是獲得最-佳的分析物回收率，同時(shí)最-大程度地減少到達(dá)最-終分析樣品的污染化合物的濃度。傳統(tǒng)的松散填充SPE產(chǎn)品易受各種技術(shù)問題的影響，如樹脂裝填不足所致。在方法開發(fā)過程中，不一致的填充可能會(huì)成為問題，從而導(dǎo)致排空和通道化，從而增加了獲得不良分析物回收率的風(fēng)險(xiǎn)。

Microlute^TM CP SPE系列消除了制造過程中的松散包裝，克服了樣品制備過程中經(jīng)常遇到的常見技術(shù)問題。取而代之的是，它由*的，固態(tài)的雜化聚合物結(jié)果組成，該結(jié)構(gòu)由固定在固位介質(zhì)上的均勻分布的孔的互連網(wǎng)絡(luò)組成。這種設(shè)計(jì)可增強(qiáng)樣品的流通性，以最-大程度地提高分析物與固相之間的相互作用，從而提供高度可重復(fù)的SPE方法。

本應(yīng)用描述了使用強(qiáng)陽離子交換（SCX）SPE 30 mg 96孔微孔板的SPE LC/MS方法，用于測定人尿中的12種阿片類藥物。它還檢查了雜化聚合物產(chǎn)品相對(duì)于散裝板的性能優(yōu)勢。

介紹

阿片類藥物危機(jī)

阿片類藥物被認(rèn)為是緩解疼痛最-有效的藥物，被歸類為減輕患者痛苦的重要部分[1].。這類藥物在止痛方面的功效，也被用于娛樂目的而引起很多爭議。因阿片類藥物使用的正?；?，而導(dǎo)致*對(duì)它們廣泛成癮和濫用。據(jù)估計(jì)，歐洲在2017年[2]又130萬高風(fēng)險(xiǎn)使用者，而美國2018 [3]年估計(jì)有1030萬 12歲以上的人濫用阿片類藥物。

 隨著阿片類藥物濫用的增加，在實(shí)驗(yàn)室檢測阿片類藥物的存在變得更為重要，用以幫助發(fā)現(xiàn)濫用阿片類藥物的患者，同時(shí)仍使其他患者正常使用阿片類藥物緩解疼痛。實(shí)驗(yàn)室測試對(duì)于幫助解決美國的阿片類藥物危機(jī)起著關(guān)鍵作用。Quest診斷人員（美國國家大型臨床實(shí)驗(yàn)室）分析了其2011年至2017年藥物測試數(shù)據(jù)，其中包含了390萬個(gè)身份不明的藥物檢測測試。該報(bào)告指出，從2011年至2017年，每年進(jìn)行的大多數(shù)測試均被歸類為與規(guī)定量的預(yù)期結(jié)果不一致。因此，可以從這些結(jié)果中得出結(jié)論，需要進(jìn)行測試以確認(rèn)患者是否正在濫用處方或?qū)⑵渌欠ㄋ幬锱c處方一起使用。如果患者按照處方使用阿片類藥物或無視他們的計(jì)劃并導(dǎo)致濫用，則可以通過色譜尿液藥物測試來進(jìn)行最-終驗(yàn)證。

阿片類藥物的檢測

目前有兩種檢測尿樣阿片類藥物的方法：一種免疫分析篩選測試和一種色譜測試。標(biāo)準(zhǔn)的阿片類藥物免疫測定通常設(shè)計(jì)用于檢測天然嗎-啡樣分子（嗎-啡和可待-因），但不能檢測到諸如芬-太-尼和美-沙-酮之類的合成阿片類藥物。使用色譜技術(shù)的優(yōu)勢在于可以通過一種方法識(shí)別所有不同的阿片類藥物，以針對(duì)不同的類別。它還提供了樣品中每個(gè)阿片類藥物的定量結(jié)果，而不是定性免疫分析結(jié)果。

其他測定尿液中阿片類藥物的技術(shù)包括色譜法“dilute and shoot”，該方法涉及用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋樣品并直接注入LC-MS系統(tǒng)。但是，與固相萃取（SPE）方法相比，它不能濃縮樣品。由于尿樣中經(jīng)常存在少量的阿片類藥物，這可能會(huì)導(dǎo)致加陰性，尤其是在質(zhì)譜儀上反應(yīng)不強(qiáng)烈的阿片類藥物。SPE還可以從尿液樣品中去除“dilute and shoot”中存在的任何基質(zhì)成分。這些會(huì)影響阿片類藥物的電離并在MS離子源中積累，導(dǎo)致結(jié)果不可靠。還將導(dǎo)致更長的測試交付時(shí)間，昂貴的重新測試以及更長的儀器維護(hù)時(shí)間。

本應(yīng)用簡報(bào)展示了如何將SCX混合模式SPE方法與UHPLC-MS/MS相結(jié)合使用，以可靠，可重復(fù)的方式分析人尿液樣品中的12中天然，半合成和合成阿片類藥物和代謝物。

化合物

嗎-啡，羥-嗎-啡-酮，去-甲-羥-考-酮，氫-可-酮，去-甲-氫-可-酮，O-去-甲-基-順-式-曲-馬-多，降-芬-太-尼，順-式-曲-馬-多，哌-啶，芬-太-尼，E-D-D-P，美-沙-酮。 所有化合物均以1 mg / mL的形式從Cerilliant購買。

樣品制備

在甲醇中制備了所有阿片類物質(zhì)（3ug/ml）的儲(chǔ)備液。為了制備尿液樣品，將12.5ml混合來源的混合性別的空白人尿加入625ul阿片樣物質(zhì)儲(chǔ)備溶液。通過向12.5ml尿液中加入625 µL甲醇來制備空白。樣品和空白均用1％甲酸的水溶液以1：1稀釋，并渦旋1分鐘以使溶液均質(zhì)。

對(duì)于混合模式SPE，Microlute™CP SCX 30 mg 96孔板的每個(gè)孔（目錄號(hào)PSCX030P-001）用1,000 µL甲醇調(diào)理，然后用1,000 µL水平衡。將每個(gè)預(yù)處理的樣品和空白樣品*加到孔板中。上樣后，用1,000 µL的0.1％甲酸水溶液洗滌每個(gè)孔，然后加入1,000 µL的0.1％甲酸甲醇溶液。 每個(gè)孔用2 x 400 µL 45:45:10脫甲醇/乙腈/ TEA洗脫。在室溫下，使用帶有直針的96針頭（目錄號(hào)229036）和 氮吹儀MiniVap Gemini（目錄號(hào)500234）在N2下蒸發(fā)洗脫至干燥，大約需要45分鐘。在100 µL起始流動(dòng)相（水中0.1％甲酸）中重構(gòu)樣品。峰值后標(biāo)準(zhǔn)由100 µL在起始流動(dòng)相（0.1％甲酸的水溶液）中稀釋的阿片樣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（1500 ng / mL）重建空白溶液孔。在市售的散裝96孔板上也進(jìn)行了相同的操作（圖1）。

結(jié)果與討論

色譜法

150 ng / mL校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品中所有化合物的色譜圖如圖2所示。色譜圖的峰分配可以在表1中找到。

LC方法始于100％的水溶液，以確保在進(jìn)樣開始之前先洗脫洗脫溶液中仍可能存在的鹽和最-具極性的組分，然后再從色譜柱上洗脫任何阿片類藥物。這防止那些化合物干擾阿片樣物質(zhì)的電離。

第/一個(gè)要洗脫的阿片類藥物峰是3.60分鐘的嗎啡，最后一個(gè)峰是7.71分鐘的美-沙-酮。 除氫-可-酮及其代謝物去-氫-可-酮以外，所有峰均被分離（化合物4,5）。由于前體離子的不同，這意味著沒有信號(hào)干擾。

表1中列出了分析的12種阿片類藥物和代謝物。在整個(gè)化合物范圍內(nèi)，極性各不相同：對(duì)于去甲-羥-可-待-酮，親水性最-強(qiáng)的LogP值為0.70；對(duì)于E-D-D-P，最疏水性的LogP值為5.20。 所有分析的化合物均為弱堿，pKas范圍為8.2-10.1，這意味著SCX（強(qiáng)陽離子交換）樹脂是最-適合捕獲和生產(chǎn)干凈樣品并注入LC-MS系統(tǒng)的SPE樹脂。

回收率和再現(xiàn)性

此應(yīng)用使用100 µL的重組量，這導(dǎo)致加到孔板上的1 mL尿液濃度達(dá)到原來的10倍。這樣可以提高所分析每種化合物的靈敏度。 SPE的過程通過將分析物與樹脂結(jié)合，同時(shí)洗掉尿液基質(zhì)中存在的干擾化合物，從而幫助創(chuàng)建了一種更清潔的溶液－高水位洗滌液以清除任何極性化合物，并用甲醇洗滌液洗脫疏水性酸性和中性干擾物。當(dāng)從SPE產(chǎn)品中洗脫樣品時(shí)，這兩種清洗方法有助于創(chuàng)建非常干凈的溶液，從而在洗脫步驟時(shí)將干擾降至最-低。

使用Microlute™CP SCX 96孔板進(jìn)行樣品制備后，測量加到人尿液中的12種化合物中每種化合物的回收率。圖3顯示了從尿樣加標(biāo)樣品前樣品制備物中回收的所有化合物的平均回收率，大小為12個(gè)重復(fù)樣品中的所有化合物。除哌-啶和E-D-D-P外，所有阿片類藥物的回收率均大于80％。

使用與Microlute™CP SCX板上相同的方法，將回收率與市售30 mg散裝產(chǎn)品進(jìn)行比較。兩種產(chǎn)品的比較結(jié)果見圖4。與雜化聚合物相比，松散填充產(chǎn)品的回收率表明每種分析物的回收率都有所下降。提出這種減少是由于雜化聚合物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在分析物和色譜介質(zhì)之間提供了更有效的相互作用。結(jié)果，整個(gè)Microlute™CP SCX板的整體上減少了分析物和溶劑的通道效應(yīng)。

導(dǎo)流是液體沿著阻力最-小的路徑通過SPE床的過程。因此，當(dāng)尿液加到孔板上，由于穿過SPE床的流動(dòng)路徑不均勻，它可能無法與所有存在的樹脂*相互作用。這有效地降低了產(chǎn)品的負(fù)載能力，并可能破壞分析物，導(dǎo)致回收率低。第二個(gè)問題是洗脫時(shí)，與雜化聚合物的洗脫量相比，溶劑與結(jié)合的分析物的接觸較少，這可能導(dǎo)致回收率降低，并且需要更大的洗脫量。

孔間可重復(fù)性是衡量96孔板不同孔之間每個(gè)回收結(jié)果彼此之間有多接近的一種度量。這是確保對(duì)所收集結(jié)果有信心的一項(xiàng)重要措施。如果記錄的重現(xiàn)性很低，可能會(huì)對(duì)收集的結(jié)果產(chǎn)生懷疑。對(duì)于方法驗(yàn)證，重要的指標(biāo)是查看建議的指導(dǎo)原則以及可接受的級(jí)別。色譜生物分析測定法通常在LOD或LOQ水平[12、13、14]時(shí)，其RSD指標(biāo)<15％或<20％[12、13、14]。這是一項(xiàng)非常重要的測試方法，您需要像阿片類藥物測試那樣放心，這可能會(huì)對(duì)接受測試的患者造成重大后果。

圖5顯示了回收率結(jié)果的％RSD。數(shù)據(jù)顯示％RSD值范圍從嗎-啡的1.39％到E-D-D-P的5.95％。這些數(shù)字表明，這12個(gè)重復(fù)的重現(xiàn)性很好地落入了通常用于方法驗(yàn)證的％RSD指南的典型建議限值內(nèi)。

概括

Microlute™ CP SCX能夠檢測尿液中的各種阿片類藥物，包括天然，半合成和合成化合物，使其成為濫用藥物分析的明顯選擇。SPE的過程允許樣品濃縮，從而可以對(duì)較低濃度的樣品進(jìn)行更/靈敏的分析。對(duì)于‘dilute and shoot’方法，這是不可能的，因?yàn)樵摲椒ǖ暮诵脑硎窍♂寴悠贰?/span>Microlute™ CP SCX微孔板還可以在不同類別的阿片類藥物范圍內(nèi)提供有利的回收率，重現(xiàn)性低于RSD值的10%。這樣可以確保產(chǎn)品提供可靠和可重復(fù)的結(jié)果，這是在藥物測試中需要對(duì)數(shù)據(jù)輸出充滿信心的重要指標(biāo)。

References:

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